Per svolgere in maniera corretta una Real Time PCR è fondamentale scegliere in maniera opportuna il gene di riferimento, ovvero quello che non varia nella sua espressione tra differenti campioni o condizioni sperimentali.
Lo studio approfondito delle condizioni sperimentali e di quanto già presente in letteratura è importante per comprendere verso quali geni orientarsi.
Tuttavia, altrettanto importante è eseguire una Real Time "di prova" per fare un analisi di almeno tre, quattro geni al fine di testare il loro comportamento nelle proprie condizioni sperimentali.
A questo punto, come fare per orientarsi nella giungla dei cicli soglia ottenuti? Quale sarà il gene, che in maniera statisticamente significativa non varia?
Per saperlo ci viene in aiuto NormFinder, una semplice "MACRO" che si può aggiungere molto facilmente ad Excel: è possibile scaricarla dal sito
http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm.
http://www.mdl.dk/publicationsnormfinder.htm.
Una volta scaricata la macro, occorre ricordare di inserire nel classico foglio Excel i dati ottenuti dalla Real Time in forma logaritmica (è bene possedere almeno un triplicato per ogni gene). In cambio, nel giro di pochi secondi, ci viene restituito un valore di stabilità per ogni gene testato. Esso è una misura diretta della variazione stimata dell'espressione genica e permette di distinguere quel gene che ha una minor variazione tra i campioni e le condizioni testate.
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